Quelles techniques pour éditer le génome?

Quelles techniques pour éditer le génome?
CRISPR-Cas9 fait beaucoup parler d’elle, mais ce n’est ni la première, ni la seule technique utilisée pour éditer le génome.

Peu de techniques scientifiques ont connu autant de progrès au cours de la dernière décennie que l’édition du génome. Son but: permettre de modifier le code génétique d’une cellule de manière précise, pour inactiver un gène ou en insérer un nouveau. Il est également possible d’introduire ou de corriger des mutations ciblées.

Des outils de biologie moléculaire sont disponibles depuis les années 1980, mais ils ont depuis connu des évolutions majeures. L’avènement de la technique CRISPR-Cas9 en 2012 a notamment représenté un véritable tournant dans le monde de la génétique. Dans tous les domaines de la médecine, en passant par l’agronomie ou les sciences environnementales, elle révolutionne les méthodes de travail et repousse les limites des expériences qui peuvent être réalisées.

«Ce qui est intéressant, c’est qu’aucun chercheur ne s’est dit qu’il s’attelait à la tâche de chercher une nouvelle méthode d’édition du génome.

Ce sont des découvertes de biologie fondamentale qui ont été faites par hasard et dont on s’est ensuite aperçu que l’on pouvait les appliquer pour éditer le génome

», souligne Vincent Dion, professeur-boursier FNS au Centre intégratif de génomique de l’Université de Lausanne, qui vient de rejoindre l’Université de Cardiff (Royaume-Uni).

Ces différentes techniques sont toutes fondées sur l’utilisation d’enzymes – les nucléases – modifiées, sortes de ciseaux moléculaires dérivés de systèmes bactériens naturels et disposant de la capacité à couper le double brin d’ADN à un endroit spécifique. Si toutes sont encore en usage dans certains laboratoires, c’est aujourd’hui surtout CRISPR-Cas9 qui est utilisé, du fait de la facilité et rapidité de la méthode et de son coût plus faible.

CRISPR-Cas9

CRISPR-Cas9 est issue du système immunitaire des bactéries capables de se défendre contre les virus en introduisant une cassure dans leur génome. Ce mécanisme, découvert par les scientifiques Emmanuelle Charpentier et Jennifer Doudna, a ensuite été exploité pour développer un outil de biologie moléculaire qui peut être programmé afin de reconnaître des séquences d’ADN spécifiques.

Comment cela fonctionne-t-il? CRISPR est un ARN guide, qui reconnaît les séquences d’ADN cibles. Le nucléase Cas9 vient ensuite les couper. «La meilleure image est peut-être celle de ciseaux mais à tête chercheuse. Essentiellement, la méthode permet de couper à l’endroit que l’on souhaite dans le génome et c’est vraiment là son intérêt », précise Vincent Dion.

Cette cassure endommage l’ADN, qui doit alors être réparé. C’est lors de ce processus de réparation qu’il est possible de neutraliser des gènes ou même d’incorporer de nouvelles séquences d’ADN dans le génome, via un système cellulaire de réparation connu sous le nom de «recombinaison homologue». La technique peut également être employée pour corriger des mutations génétiques.

Quels sont les avantages? La méthode est simple à utiliser pour les chercheurs et beaucoup plus rapide (quelques jours, contre plusieurs semaines ou mois pour les autres techniques). Elle est aussi peu coûteuse. Ces avantages expliquent pourquoi, moins d’une décennie après avoir été développé, l’outil a été utilisé dans des milliers de recherches, à la fois fondamentales et appliquées.

Quelles sont les limites? Parmi les risques le plus souvent évoqués, celui d’introduire des mutations hors de la région du génome que l’on souhaitait changer (des «mutations hors cible»). Il peut s’agir de mutations nucléotidiques ou bien de mutations dans des régions non codantes du génome, mais certains scientifiques craignent que cela n'entraîne des effets indésirables dont on ne mesure pas encore bien les conséquences. «Cas9 est par ailleurs une protéine assez grosse, donc elle peut être difficile à introduire dans certaines cellules, dans le cadre d’une thérapie génique», ajoute Vincent Dion.

Nucléases à doigts de zinc

Comment cela fonctionne-t-il? Les nucléases à doigts de zinc sont des protéines artificielles composées de peptides dits à «doigts de zinc», qui ont pour fonction de reconnaître une séquence d’ADN. Chaque peptide peut reconnaître une courte séquence de trois nucléotides. En assemblant plusieurs peptides, on peut donc cibler des séquences plus longues et plus spécifiques. Pour rompre l’ADN, deux nucléases à doigts de zinc sont nécessaires, pour couper au niveau de deux sites proches l’un de l’autre.

Quels sont les avantages? C’est l’une des premières techniques d’édition du génome qui a été développée, rendant possible pour la première fois des expériences fondées sur l’édition du génome.

Quelles sont les limites? Il s’agit d’une technique complexe à utiliser, qui ne permet pas aussi bien que CRISPR-Cas9 de sélectionner la séquence d’ADN exacte à couper. La construction et l’assemblage des deux doigts de zinc est un processus d’ingénierie protéique long et complexe, ce qui rend la tâche d’édition du génome plus difficile. «Avec les nucléases à doigts de zinc, la difficulté était de "designer" la protéine pour introduire les mutations que l’on souhaitait», explique Vincent Dion.

Les TALENs

Comment cela fonctionne-t-il? De l’anglais «Transcription Activator Like-Effectors», les TALENs sont, comme les nucléases à doigts de zinc, utilisés par paire. Ils constituent toutefois une génération de ciseaux moléculaires un peu plus avancée. Ils sont composés de quatre peptides qui reconnaissant spécifiquement une des quatre bases de l’ADN. En assemblant plusieurs de ces peptides, on peut là aussi cibler la séquence d’ADN voulue, mais cet assemblage est encore une fois complexe à mettre en œuvre. Ces peptides sont associés à une nucléase, Fok1, qui casse le double brin d’ADN.

Quels sont les avantages? Le travail d’assemblage est plus simple que pour les nucléases à doigts de zinc car il existe des programmes informatiques qui permettent de se repérer dans le génome et de créer des «ciseaux moléculaires» pouvant reconnaître des milliers de gènes.

Quelles sont les limites? La technique reste bien plus longue et laborieuse que CRISPR-Cas9.

Les méganucléases

Réservées aux spécialistes, les méganucléases peuvent être utilisées dans le cadre de certaines recherches moléculaires fondamentales. Il s’agit d’enzymes de restriction qui, assemblées par paires, peuvent reconnaître des séquences très spécifiques (et donc limitées) d’ADN.

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